Fluorescencia del NADH
NADH
La nicotinamide Adelina dinucleótido de hidrógeno es una coenzima encargada del transporte de electrones en reacciones redox del metabolismo. Es la forma reducida del NAD+ (agente oxidante). El NAD+ es un agente oxidante que acepta electrones de otras moléculas y pasa a su forma reducida, formándose el NADH, que puede ser utilizado como agente reductor (donador de electrones).
El NADH tiene varias funciones esenciales en el metabolismo. Actúa como coenzima en las reacciones redox; como donante de grupos ADP-ribosa en las reacciones de ADP-ribosilación; como precursor del segundo mensajero de la molécula cíclica de ADP-ribosa; y como sustrato para las ADN ligasas bacterianas. El NADH absorbe fuertemente en el ultravioleta debido a la base adenina que posee y en solución tiene un pico de emisión a 460 nm y una vida útil de fluorescencia de 0,4 ns. La forma oxidada de la coenzima (NAD+) no fluoresce. Las propiedades de la señal de fluorescencia cambian cuando el NADH se une a las proteínas, por lo que estos cambios pueden ser utilizados para medir constantes de disociación, que son útiles en el estudio de la cinética enzimática.
Fluorescencia
Es la emisión de fotones por la transición electrónica de un estado excitado de singletes un estado de menor energía (estado basal).
Espectroscopía de fluorescencia
La espectroscopia es la rama de la física que se dedica al estudio de los diversos métodos de para la obtención de espectros, su medida y aplicaciones; su interpretación teórica en relación con la estructura atómica-molecular de la materia; y la relación de los estados energéticos de los átomos con las longitudes de onda que emiten.
Bioenergética celular
Una forma de detectar la bioenergética de una célula es a través de la respuesta de las coenzimas y enzimas que intervienen en el metabolismo. En este experimento se consideró la reacción de reducción-oxidación del metabolito NADH-NAD+, cuya principal función en las vías del metabolismo energético es el de transportar electrones de alta energía. En este proceso la molécula en su forma reducida (NADH) adquiere propiedades fluorescentes; lo que permite emplearla como indicador de la energética celular. La técnica de espectroscopía de fluorescencia permite obtener el espectro de emisión lumínica de una muestra fotosensible al ser excitada a una frecuencia específica. La actividad fluorescente depende de la concentración de la molécula y su actividad metabólica, el solvente y de los procesos de desactivación fluorescente.
Lactobacillus casei Shirota
Es una especie de bacteria anaerobia Gram+ que realiza la fermentación homoláctica: oxida parcialmente la glucosa para obtener energía y obtiene ácido láctico como producto de deshecho.
Es un microorganismo que se utiliza comúnmente como probiótico en productos como el Yakult, ya que genera actividad antagónica contra patógenos causantes de desordenes gastrointestinales, debido a su capacidad inmunomoduladora y a los cambios de pH generados por la producción de ácido láctico.
Desarrollo experimental
Inoculamos a los microorganismos (de muestras colectadas en Xochimilco y L. casei Shirota) en agua peptonada y los dejamos crecer por 6h. Tomamos a los microorganismos de las muestras de Xochimilco que estaban creciendo en un medio sólido Agar Eosina y Azul de Metileno. Las L. casei Shirota fueron tomadas de Yakult. El agua peptonada es un medio líquido de enriquecimiento no selectivo que permite la agitación durante la exposición a la luz UV. Es una disolución de peptona de carne y cloruro de sodio en agua. La peptona de carne es una mezcla de aminoácidos. Vaciamos estos cultivos a cubetas de cuarzo, pues este es un material que transmite la luz UV de excitación. Expusimos las muestras a radiación ultravioleta, que tiene una longitud de onda de 355nm con un láser Nd-YAG que emite a 1064nm y que se dobla con espejos a 532nm y después a 355nm, la longitud de onda deseada.
Resultados y análisis
La muestra de L. casi Shirota presentó alta intensidad de fluorescencia en el rango del NADH (440-460nm). Esto puede indicarnos una alta actividad metabólica o una alta densidad poblacional en la muestra. A pesar del doblamiento de la longitud de onda, quedan remanentes del primer haz luz del láser, y esto es lo que genera el pico de emisión que vemos en nuestra gráfica de emisión en 532nm. La muestra de microorganismos colectados en Xochimilco, a pesar de mostrar la curva característica de NADH, presentó una menor intensidad de fluorescencia. Esto puede indicarnos una baja actividad metabólica o una población pequeña de microorganismos en la muestra. La muestra blanco (medio de agua peptonada) presentó fluorescencia. Este fue un resultado no esperado, pero que explicamos con la presencia de triosina, triptofano y fenilalanina (aminoácidos que fluorescen bajo la excitación de luz UV) en el medio.
Aminoácidos presentes en el agua peptonada que presentan fluorescencia
Conclusiones
Las bacterias tienen NADH, igual que nosotros. Esto puede hablarnos de un origen común: la maquinaria molecular de procariontes y eucariontes es muy similar. La actividad metabólica o la densidad de L. casei Shirota era alta, puesto que la intensidad de fluorescencia indica una alta concentración de NADH. La actividad metabólica o la densidad de microorganismos de Xochimilco baja, dado que la intensidad de fluorescencia fue menor.
Referencias
Lombardi L., Medición del efecto del estrés oxidation sobre el metabolismo energético en neuroblastos mediante espectroscopia de fluorescencia, 2018, Universidad Autónoma Metropolitana. Brock, Biología de los microorganismos, España, 2013, 10ª ed., Pearson.
