Fluorescencia del NADH

De luz-wiki

Cuatro estudiantes (Labná Fernández, Samara Kuri, Saúl Rueda y Magalli Trujillo) de primer semestre de la carrera de biología de la Facultad de Ciencias en la UNAM hicimos un proyecto para la Semana de los Procariontes en el que buscamos demostrar experimentalmente que las bacterias tienen NADH. Para esto diseñamos un desarrollo experimental que se fundamenta en la fluorescencia que presenta el NADH al ser excitado con luz ultravioleta. Hicimos tres pruebas (bacterias L. casei Shirota, microorganismos cultivados de las muestras que tomamos en nuestra práctica de campo a Xochimilco y el medio agua peptonada como control) y encontramos resultados que nos llevaron a concluir la presencia de NADH en procariontes.

NADH

La nicotinamida adenina dinucleótido de hidrógeno es una coenzima encargada del transporte de electrones en reacciones redox del metabolismo. Es la forma reducida del NAD+ (agente oxidante). El NAD+ es un agente oxidante que acepta electrones de otras moléculas y pasa a su forma reducida, formándose el NADH, que puede ser utilizado como agente reductor (donador de electrones).

Estructura molecular del NADH

El NADH tiene varias funciones esenciales en el metabolismo. Actúa como coenzima en las reacciones redox; como donante de grupos ADP-ribosa en las reacciones de ADP-ribosilación; como precursor del segundo mensajero de la molécula cíclica de ADP-ribosa; y como sustrato para las ADN ligasas bacterianas. El NADH absorbe fuertemente en el ultravioleta debido a la base adenina que posee y en solución tiene un pico de emisión a 460 nm y una vida útil de fluorescencia de 0,4 ns. La forma oxidada de la coenzima (NAD+) no fluoresce. Las propiedades de la señal de fluorescencia cambian cuando el NADH se une a las proteínas, por lo que estos cambios pueden ser utilizados para medir constantes de disociación, que son útiles en el estudio de la cinética enzimática.

Espectro de fluorescencia del NADH puro

Fluorescencia

Es la emisión de fotones por la transición electrónica de un estado excitado de singletes un estado de menor energía (estado basal). Es un tipo particular de luminiscencia que consiste en absorber longitudes de onda electromagnéticas y emitirlas con una longitud de onda distinta, siempre mayor, puesto que la energía emitida siempre es menor a la energía absorbida. Este diferencial de energías se disipa en forma de calor. Las sustancias capaces de fluorescer se denominan fluoróforos.

Espectroscopía de fluorescencia

La espectroscopia es la rama de la física que se dedica al estudio de los diversos métodos de para la obtención de espectros, su medida y aplicaciones; su interpretación teórica en relación con la estructura atómica-molecular de la materia; y la relación de los estados energéticos de los átomos con las longitudes de onda que emiten.

Bioenergética celular

Una forma de detectar la bioenergética de una célula es a través de la respuesta de las coenzimas y enzimas que intervienen en el metabolismo. En este experimento se consideró la reacción de reducción-oxidación del metabolito NADH-NAD+, cuya principal función en las vías del metabolismo energético es el de transportar electrones de alta energía. En este proceso la molécula en su forma reducida (NADH) adquiere propiedades fluorescentes; lo que permite emplearla como indicador de la energética celular. La técnica de espectroscopía de fluorescencia permite obtener el espectro de emisión lumínica de una muestra fotosensible al ser excitada a una frecuencia específica. La actividad fluorescente depende de la concentración de la molécula y su actividad metabólica, el solvente y de los procesos de desactivación fluorescente.

Lactobacillus casei Shirota

Es una especie de bacteria anaerobia Gram+ que realiza la fermentación homoláctica: oxida parcialmente la glucosa para obtener energía y obtiene ácido láctico como producto de deshecho.

Lactobacillus casei Shirota

Es un microorganismo que se utiliza comúnmente como probiótico en productos como el Yakult, ya que genera actividad antagónica contra patógenos causantes de desordenes gastrointestinales, debido a su capacidad inmunomoduladora y a los cambios de pH generados por la producción de ácido láctico.

Desarrollo experimental

Inoculamos a los microorganismos (de muestras colectadas en Xochimilco y L. casei Shirota) en agua peptonada y los dejamos crecer por 6h. Tomamos a los microorganismos de las muestras de Xochimilco que estaban creciendo en un medio sólido Agar Eosina y Azul de Metileno. Las L. casei Shirota fueron tomadas de Yakult. El agua peptonada es un medio líquido de enriquecimiento no selectivo que permite la agitación durante la exposición a la luz UV. Es una disolución de peptona de carne y cloruro de sodio en agua. La peptona de carne es una mezcla de aminoácidos. Vaciamos estos cultivos a cubetas de cuarzo, pues este es un material que transmite la luz UV de excitación. Para la muestra del blanco (agua peptonada), hicimos tres celdas distintas. En la primera filtramos el medio por un filtro de tamaño de poro de 0.2 micrómetros, para asegurar que no teníamos contaminación de microorganismos. La segunda fue el medio sin filtrar y la tercera fue agua destilada. Expusimos las muestras a radiación ultravioleta, que tiene una longitud de onda de 355nm con un láser Nd-YAG que emite un haz de 1064nm que se duplica (532nm) y triplica (355nm) con los cristales apropiados. Para obtener el espectro de emisión de las muestras se usó un espectrómetro que detecta los fotones que llegan a través de una fibra óptica. Éste los cuantifica y nos arroja los datos a la computadora de la intensidad de emisión en cada longitud de onda.

Arreglo experimental Fluorescencia de L. casei Shirota

Resultados y análisis

Gráfica comparativa de espectros de emisión

La muestra de L. casi Shirota presentó alta intensidad de fluorescencia en el rango del NADH (440-460nm). Esto puede indicarnos una alta actividad metabólica o una alta densidad poblacional en la muestra. A pesar del doblamiento de la longitud de onda, quedan remanentes del primer haz luz del láser, y esto es lo que genera el pico de emisión que vemos en nuestra gráfica de emisión en 532nm. La muestra de microorganismos colectados en Xochimilco, a pesar de mostrar la curva característica de NADH, presentó una menor intensidad de fluorescencia. Esto puede indicarnos una baja actividad metabólica o una población pequeña de microorganismos en la muestra. La muestra blanco sin filtrar presentó fluorescencia, lo cual quiere decir que el medio estaba contaminado. La muestra blanco filtrada presentó fluorescencia pero con una intensidad mucho menor, lo cual nos indica que con el filtro pudimos eliminar una gran parte de los contaminantes del medio. El agua destilada no presentó fluorescencia, resultado que esperábamos de estas tres últimas muestras. Es posible que el problema de contaminación del medio venga del almacenamiento del medio sólido en el laboratorio de la facultad, puesto que repetimos esta parte del experimento tres veces, tomando cada vez mayores medidas de esterilidad (se esterilizaron las celdas de cuarzo, las moscas magnéticas y las tapas de teflón con luz UV, se hizo el vaciado de la muestra en un cuarto estéril, se usó agua destilada que no presentó fluorescencia, se esterilizó el medio líquido en tubos de medio en autoclave) y no logramos eliminar completamente la curva del NADH en el blanco. Dada la intensidad de fluorescencia de los microorganismos de Xochimilco y las L. casei Shirota podemos decir que sí eran ellas las que emitían fluorescencia y no únicamente el medio, lo cual nos permite hacer el análisis de presencia de NADH en procariontes.

Conclusiones

Las bacterias tienen NADH, igual que nosotros. Esto puede hablarnos de un origen común: la maquinaria molecular de procariontes y eucariontes es muy similar. La actividad metabólica o la densidad de L. casei Shirota era alta, puesto que la intensidad de fluorescencia indica una alta concentración de NADH. La actividad metabólica o la densidad de microorganismos de Xochimilco baja, dado que la intensidad de fluorescencia fue menor.

Agradecimientos

Agradecemos a todo el equipo de la UAM-Iztapalapa que nos apoyó en la realización de este experimento, en particular a Lucrecia Lombardi, que nos acompañó en todo el proceso experimental y teórico y también a Rafael Godinez, Carlos García y Manuel Fernández.

Referencias

Lombardi L., Medición del efecto del estrés oxidativo sobre el metabolismo energético en neuroblastos mediante espectroscopia de fluorescencia, 2018, Universidad Autónoma Metropolitana. Brock, Biología de los microorganismos, España, 2013, 10ª ed., Pearson.